DNA 组装试剂盒可解锁 CRISPR-Cas9 在代谢工程中的潜力

模块化工具包结构 - 该工具包由七个模块组成，可快速轻松地组装整合构建体和 Cas9 辅助质粒。Lvl0 模块：入门载体中的单个部件。Exp 模块：过表达构建体的组装。Pro 模块：新启动子的组装和筛选。Del 模块：破坏构建体的组装。Int 模块：通过同源臂交换改变整合位点。MEx 模块：通过可选择标记切除组装无标记构建体。Cas 模块：将 Cas9 辅助质粒重定向到新的基因组位点。五个模块 - Pro、Del、Cas、Int 和 MEx 模块 - 代表了一种新方法，可在功能上扩展以前使用的 GG 组装系统。Pro、Del 和 Int 模块的组装基于单个 GG 反应，而 Cas 和 MEx 模块涉及在特殊大肠杆菌菌株中发生的同源和位点特异性重组。模块之间的箭头表示可以应用它们的不同顺序，以实现可变基因组工程技术，如上图所示，酵母。来源：*自然通讯生物学*, doi: https://doi.org/10.1038/s42013-023-05202-5

成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 和 Crispr 相关蛋白 9 (CRISPR/Cas9) 现在是一种众所周知的、革命性的微生物细胞改造方法。

CRISPR 的一个关键优势在于菌株设计有利于染色体整合，从而能够组装无标记 DNA。这些编辑系统非常有益；然而，它们的组装并不十分简单，可能会阻碍其使用和应用。

在一份新报告中自然通讯生物学Tigran V. Yuzbashev 及其研究团队发现了现有 Cas9 工具包的局限性，这些工具包旨在使 CRISPR 技术更易于获取和实施。他们讨论了三种不同的成熟方法，并将它们结合起来，形成了一个全面的工具包，用于利用 CRISPR/Cas9 进行高效的代谢工程。

一个由 147 个质粒组成的工具包，用于生成和鉴定 137 个启动子库，以构建尿黑酸在实验室里。

使用 CRISPR/Cas9 进行基因组修饰

CRISPR/Cas9 系统可以快速、精确且无疤痕地进行基因组修饰，为设计用于生物生产的微生物菌株提供了巨大的空间。例如，酵母的代谢工程为工程生物学提供了一个快速发展的领域，用于持续生产化学品、燃料、食品和药品。

酵母具有与真核细胞类似的代谢潜力，因此更容易进行工程改造和大规模培养。因此，生物工程师们设计并开发了酵母的 CRISPR 系统。

由于效率高，CRISPR 可以实现无标记基因组修饰。在这项研究中，Yuzbashev 通过确定 CRISPR/Cas9 系统在酵母工程中的三种改进，确保了菌株优化并促进了代谢工程项目。这些方法包括：1) 标记和无标记修饰之间的轻松交换，2) 快速交换同源臂以确定不同的整合位置，以及 3) 一种简单的克隆方法gRNA。

使用 CRISPR/Cas9 筛选启动子库。在 Pro 模块中，使用 RFP 退出选择，只需一个 GG 步骤即可轻松组装扩增的启动子。所得 Pro 系列质粒可用于 Exp 模块中的 TU 组装和整合到酵母基因组后进行启动子测定。共转化的 Cas9 辅助质粒促进了单拷贝整合到标准基因座中。转化子首先通过由游离辅助编码的 Nat 抗性进行选择，然后通过 Ura⁺表型验证确认了构建体的整合。图中的 96 孔板展示了在 YPD 培养基中生长的含有 93 个天然启动子的 Y. lipolytica 转化体文库的荧光（补充材料第 8.1 节）。两个底部面板包含条形图，其中分别使用平板读数器和流式细胞仪测定了 93 个天然启动子和 43 个混合启动子。使用亲本菌株 S234（0%）对数据进行空白处理，并通过 TEF1 启动子活性（100%）进行标准化。对于每个启动子，在最低（蓝色）和丰富（红色）培养基中测定 GFP 荧光，其中 2% 葡萄糖（YNBD、YPD）或 2% 甘油（YNBG 和 YPG）作为碳源。来源：*自然通讯生物学*, doi: https://doi.org/10.1038/s42013-023-05202-5

无标记整合

为了实现基于 CRISPR 的无标记整合，该团队选择了 Cas9 诱导的双链断裂，必须修复该断裂才能实现细胞增殖。科学家们通过使用模板或供体实现了这一点，通过或者非同源末端连接（NHEJ）——没有整合。非同源末端连接的过程在大多数包括面包酵母酿酒酵母。

在具有主要 NHEJ 机制的物种中，该团队通过删除 NHEJ 基因来增强同源重组。如果无标记方法没有成功，科学家随后旨在改进 CRISPR-Cas9 辅助整合，以轻松恢复基于标记的整合。

供体 DNA 重定向

Cas9 辅助整合通常需要一个供体模板，该模板由一个集成盒和两个同源臂组成。该团队推测，CRISPR/Cas9 的理想整合应该通过简化的金门组装反应。

此外，启动子是任何代谢工程项目的关键要素，它可以将流量重新导向感兴趣的产品Yuzbashev 等人利用工业酵母解脂耶氏酵母开发一种结合基因编辑和 DNA 组装策略的代谢工程工具包和多功能性。

代谢工程工具包的验证。a) 在 Y. lipolytica 中设计的 HGA 生成途径的示意图。绿色箭头表示过度表达的步骤。红色箭头表示失活的反应。紫色箭头表示酶促反应，据信由 Y. lipolytica HGA 降解簇中的另外两个 ORF 编码。编码相应酶促步骤的基因显示在反应旁边。代谢物缩写如下：PEP 磷酸烯醇丙酮酸、E4P 赤藓糖-4-磷酸、DAHP 3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸 7-磷酸、DHQ 3-脱氢奎尼酸、DHS 3-脱氢莽草酸、SHIK 莽草酸、SHP 莽草酸-3-磷酸、EP3P 5-烯醇丙酮酸-莽草酸-3-磷酸、CHA 分支酸、PPA 预苯酸盐、HPP 对羟基苯丙酮酸、PPY 苯丙酮酸、MAA 4-马来酰乙酰乙酸酯、FAA 4-富马酰乙酰乙酸酯、FUM 富马酸、AAС 乙酰乙酸酯、Tyr L-酪氨酸、Phe L-苯丙氨酸。b) 总结在 HGA 生产菌株中引入的修改。delta 和向上箭头符号分别用于表示相应基因的缺失和过表达。 c) 在含有 9% 葡萄糖的 YNB 培养基中培养 14 天后，工程菌株积累了 HGA。图中显示了两个生物学重复。d) 在含有 2% 柠檬酸盐的 YNB 培养基中培养 7 天后，工程菌株在培养液中明显积累了脓黑色素。来源：*自然通讯生物学*, doi: https://doi.org/10.1038/s42013-023-05202-5

工具包的模块化架构和代谢途径工程

科学家们通过开发一种工具包来扩展 CRISPR/Cas9 在代谢工程方面的全部潜力以前众所周知Golden Gate 组装系统。他们通过生成多个启动子库来测试筛选系统。Yuzbashev 等人选择了编码大亚基和小亚基蛋白质的 Y. lipolytica 核糖体基因。他们确定了具有不同强度的多种启动子，以扩大同一生物体的启动子数量。

为了证明增强型 CRISPR/Cas9 方法的影响和用途，该团队通过合理改造创建了一种解脂耶氏酵母，以产生一种尿黑酸（HGA）。通常在碱性条件下，HGA会自发发生氧化，形成自聚合黑色素；优秀的组成部分天然防晒霜和化妆品。

尽管具有很高的商业潜力，但现有的生产酸性前体和黑色素产品的方法依赖于昂贵的芳香族氨基酸为了促进代谢工程，研究小组首先选择了几个编码前体芳香族氨基转移酶作为工程目标。然后，他们选择了三个过表达目标来增强尿黑酸在最后，他们研究并灭活了 HGA 降解途径；这是 Y. lipolytica 中尚不清楚的一条途径。

使用 CRISPR/Cas9 工具包加速代谢工程的原理。该工具包允许在基于标记和无标记的整合之间频繁切换，结合了两种技术的优势。更强大的基于标记的整合至少需要 11 天，因为它包括标记恢复程序。使用 CRISPR/Cas9 的无标记整合可在五天内完成一次整合（图像，顶部）。任何单个 GG 组装反应都可用于生产有标记和无标记的载体。同时，使用 HA 交换系统，任何组装的用于过表达的整合盒，无论其复杂程度如何，都可以在两天内重定向到基因组的替代位点。此外，gRNA 和供体都可以在两天内重定向到替代位点（图像，左下）。来源：*自然通讯生物学*, doi: https://doi.org/10.1038/s42013-023-05202-5

外表

通过这种方式，Tigran V. Yuzbashev 及其同事展示了生物体代谢工程对高效 DNA 操作方法的依赖。这项研究展示了为基于 CRISPR/Cas9 的代谢工程设计的增强分子工具包的一个例子。

科学家们证明了该平台在快速构建菌株和鉴定大型启动子库方面的功能。他们期待该工具包在菌株工程和工业领域有更广泛的应用。该团队设想，这项工作中开发的解脂耶氏酵母模型也将在生物工程的其他领域有广泛的应用。

引用: 一种 DNA 组装试剂盒，可解锁 CRISPR-Cas9 在代谢工程中的潜力 (2023 年 8 月 30 日) 于 2024 年 6 月 9 日检索自 https://webbedxp.com/zh-CN/science/jamaal/news/2023-08-dna-kit-crispr-cas9-potential-metabolic.html

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