用於準確估計植物基因組大小的流式細胞儀指南

北卡羅來納州立大學的研究人員最近發布的一項研究為使用流式細胞儀準確估計植物基因組大小提供了新的見解和指南。

50 多年來，流式細胞儀已廣泛用於估計植物的相對和絕對基因組大小（DNA 含量）。然而，由於許多因素，這些估計的準確性可能會有很大差異，包括參考標準和各種實驗方法的基因組大小估計的誤差。

這項最新研究重新審視了長期以來的假設，確定了變異來源，並建立了最佳實踐和參考標準，並更新了基因組大小，以提高基因組大小估計的精度和可靠性。它還嚴格檢查所使用的方法，並提供解決不一致問題和提高準確性的指南。該研究是發表在美國園藝學會雜誌。

本研究的具體目標是重新評估常用參考標準的基因組大小，並量化估計植物基因組大小時因緩衝液、混雜因素而產生的變異和誤差來源。、組織類型和植物參考標準，使用 4?,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 和碘化丙啶 (PI) 螢光染料。進行了五項獨立的研究來闡明這些目標。

第一項研究著重於螢光染料效應。植物中使用多種螢光染料但它們對整個基因組染色的有效性、染色質對染色效果的影響以及緩衝液和植物代謝物對染料螢光的影響仍然很大程度上未知。

由於染色、鹼基對偏差和孵育時間的差異，不同螢光染料的估計植物基因組大小有顯著差異。此外，密集染色質染色的功效和螢光對幹擾代謝物的敏感性等因素也會影響基因組大小估計的準確性。

第二項研究調查了緩衝液效應，這對於流式細胞儀樣本製備中的細胞核分離和染色至關重要。這些緩衝劑可以單獨或組合，通常包括界面活性劑、等滲劑、pH 緩衝劑、酚類結合劑（如聚乙烯吡咯烷酮）、DNA 保存化合物（如精胺）以及 RNA 或蛋白質降解酶。

由於組織類型、形態和代謝物成分多種多樣，緩衝液針對特定應用進行了最佳化，常用的緩衝液多達 28 種。

第三項研究對代謝效應進行了分類。植物中的多種次級代謝物在分類群和組織之間可能存在顯著差異，導致使用流式細胞儀估計基因組大小時出現錯誤。花青素、咖啡因等化合物，、香豆素、鞣花酸、單寧酸等可以與螢光染料和核 DNA 相互作用，導致基因組大小的低估或高估。

第四項關於組織類型影響的研究發現，植物組織的選擇顯著影響使用流式細胞儀估計基因組大小。影響這一點的因素包括起源器官、組織狀態（活的、死的或固定的）以及胞質化合物的存在。組織中不同類型和數量的不同次級代謝物可能會造成組織特異性幹擾。

參考標準效應構成了第五項研究。在流式細胞儀中，包含已知基因組大小的參考標準對於準確計算未知樣本的基因組大小至關重要。使用人類雄性白血球作為主要標準，並使用 DAPI 和 PI 螢光染料更新基因組大小（6.15 pg；比早期研究低 12.14%），確定了常用植物參考標準的基因組大小的修訂估計值。

結果表明，流式細胞儀可以精確、重複地測定相對植物基因組大小和倍性，如果使用一致的方法，它對於密切相關的植物很有價值。然而，準確確定絕對基因組大小仍然具有挑戰性，應視為近似值，潛在誤差為 ±29% 或更多。

影響準確性的因素包括螢光染料、萃取緩衝液、組織類型、參考標準和植物代謝物，它們會影響螢光染料結合和螢光。

總體而言，當使用一致的方法時，無論螢光染料如何，流式細胞儀都可以精確、可重複，並且對於確定密切相關植物的相對基因組大小和倍性非常有價值。

然而，透過流式細胞儀準確測定絕對基因組大小仍然難以實現，並且使用流式細胞儀對基因組大小的估計應被視為粗略近似值，其可能隨實驗方法和植物環境的變化而變化±29%或更多。提供了最佳實踐的其他建議。

這項研究對於研究人員、育種者和生物技術人員來說意義重大。準確的基因組大小估計對於多種應用至關重要，包括植物育種、遺傳圖譜和生物多樣性研究。本研究建立的新指南和參考標準有望進一步提高流式細胞儀估計植物侏儒大小的準確性和精確度。

作者表示，「隨著我們的實驗室積極參與植物育種、遺傳學、細胞遺傳學和作物改良，流式細胞儀是快速估計植物倍性和相對基因組大小的極其有價值的工具。然而，幾十年來一直在使用這項技術，很明顯，這些估計值在多大程度上受到方法變化的影響。

「由於流式細胞儀在使用一致的方法時是精確且可重複的，因此經常被錯誤地假設和聲明它是『準確的』。在這項研究中，我們能夠重新評估常用參考標準的基因組大小，並量化估計植物基因組大小時的變異和誤差來源，這些變異和誤差是由於使用不同的組織和方法而產生的，可能導致±29 %或更多的誤差。

「此外，使用過時的基因組大小估計值的參考標準導致了 12% 或更多的額外誤差。這項研究提供了參考標準的基因組大小的改進估計、量化的誤差來源，並建議改進植物基因組大小的估計。