用于准确估计植物基因组大小的流式细胞术指南

北卡罗来纳州立大学的研究人员最近发布的一项研究为使用流式细胞术准确估计植物基因组大小提供了新的见解和指南。

50 多年来，流式细胞术已广泛用于估计植物的相对和绝对基因组大小（DNA 含量）。然而，由于许多因素，这些估计的准确性可能会有很大差异，包括参考标准和各种实验方法的基因组大小估计的误差。

这项最新研究重新审视了长期以来的假设，确定了变异来源，并建立了最佳实践和参考标准，并更新了基因组大小，以提高基因组大小估计的精度和可靠性。它还严格检查所使用的方法，并提供解决不一致问题和提高准确性的指南。该研究是发表在美国园艺学会杂志。

本研究的具体目标是重新评估常用参考标准的基因组大小，并量化估计植物基因组大小时因缓冲液、混杂因素而产生的变异和误差来源。、组织类型和植物参考标准，使用 4?,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 和碘化丙啶 (PI) 荧光染料。进行了五项独立的研究来阐明这些目标。

第一项研究侧重于荧光染料效应。植物中使用多种荧光染料但它们对整个基因组染色的有效性、染色质对染色效果的影响以及缓冲液和植物代谢物对染料荧光的影响仍然很大程度上未知。

由于染色、碱基对偏差和孵育时间的差异，不同荧光染料的估计植物基因组大小存在显着差异。此外，密集染色质染色的功效和荧光对干扰代谢物的敏感性等因素也会影响基因组大小估计的准确性。

第二项研究调查了缓冲液效应，这对于流式细胞术样品制备中的细胞核分离和染色至关重要。这些缓冲剂可以单独或组合，通常包括表面活性剂、等渗剂、pH 缓冲剂、酚类结合剂（如聚乙烯吡咯烷酮）、DNA 保存化合物（如精胺）以及 RNA 或蛋白质降解酶。

由于组织类型、形态和代谢物成分多种多样，缓冲液针对特定应用进行了优化，常用的缓冲液多达 28 种。

第三项研究对代谢效应进行了分类。植物中的多种次生代谢物在分类群和组织之间可能存在显着差异，导致使用流式细胞术估计基因组大小时出现错误。花青素、咖啡因等化合物，、香豆素、鞣花酸、单宁酸等可以与荧光染料和核 DNA 相互作用，导致基因组大小的低估或高估。

第四项关于组织类型影响的研究发现，植物组织的选择显着影响使用流式细胞术估计基因组大小。影响这一点的因素包括起源器官、组织状态（活的、死的或固定的）以及胞质化合物的存在。组织中不同类型和数量的不同次生代谢物可能会引起组织特异性干扰。

参考标准效应构成了第五项研究。在流式细胞术中，包含已知基因组大小的参考标准对于准确计算未知样本的基因组大小至关重要。使用人类雄性白细胞作为主要标准，并使用 DAPI 和 PI 荧光染料更新基因组大小（6.15 pg；比早期研究低 12.14%），确定了常用植物参考标准的基因组大小的修订估计值。

结果表明，流式细胞术可以精确、重复地测定相对植物基因组大小和倍性，如果使用一致的方法，它对于密切相关的植物很有价值。然而，准确确定绝对基因组大小仍然具有挑战性，应视为近似值，潜在误差为 ±29% 或更多。

影响准确性的因素包括荧光染料、提取缓冲液、组织类型、参考标准和植物代谢物，它们会影响荧光染料结合和荧光。

总体而言，当使用一致的方法时，无论荧光染料如何，流式细胞术都可以精确、可重复，并且对于确定密切相关植物的相对基因组大小和倍性非常有价值。

然而，通过流式细胞术准确测定绝对基因组大小仍然难以实现，并且使用流式细胞术对基因组大小的估计应被视为粗略近似值，其可能随实验方法和植物环境的变化而变化±29%或更多。提供了最佳实践的其他建议。

这项研究对于研究人员、育种者和生物技术人员来说意义重大。准确的基因组大小估计对于多种应用至关重要，包括植物育种、遗传图谱和生物多样性研究。本研究建立的新指南和参考标准有望进一步提高流式细胞术估计植物侏儒大小的准确性和精确度。

作者表示，“随着我们的实验室积极参与植物育种、遗传学、细胞遗传学和作物改良，流式细胞术是快速估计植物倍性和相对基因组大小的极其有价值的工具。然而，几十年来一直在使用这项技术，很明显，这些估计值在多大程度上受到方法变化的影响。

“由于流式细胞术在使用一致的方法时是精确且可重复的，因此经常被错误地假设和声明它是‘准确的’。在这项研究中，我们能够重新评估常用参考标准的基因组大小，并量化估计植物基因组大小时的变异和误差来源，这些变异和误差是由于使用不同的组织和方法而产生的，可能导致±29%或更多的误差。

“此外，使用过时的基因组大小估计值的参考标准导致了 12% 或更多的额外误差。这项研究提供了参考标准的基因组大小的改进估计、量化的误差来源，并建议改进对植物基因组大小的估计。”