CRISPR 激發了基因編輯的新技巧

科學家通常會迴避使用這個詞奇蹟——除非他們談論的是名為 CRISPR/Cas9 的基因編輯工具。 「你可以用 CRISPR 做任何事情，」有人說。 其他人只是稱其為神奇。

CRISPR 幾乎可以快速有效地操縱任何植物或動物中的任何基因。 自 CRISPR 出現以來的四年裡，研究人員已經利用它來修復動物的遺傳疾病、對抗病毒、消滅蚊子以及為人體移植準備豬器官。 大多數專家認為這只是一個開始。 CRISPR 的強大可能性——甚至是創造「設計嬰兒」和消滅整個物種的有爭議的概念——令人震驚，有時甚至令人恐懼。

到目前為止，CRISPR 的最大影響已經體現在世界各地的基礎生物學實驗室中。 這種價格低廉、易於使用的基因編輯器使研究人員能夠以以前困難或不可能的方式深入研究生命的基本奧秘。 發育生物學家羅伯特·里德將 CRISPR 比喻為電腦老鼠。 “你只需將它指向基因組中的一個位置，你就可以在那個位置做任何你想做的事情。”

任何事情，只要牽涉到切割DNA。 CRISPR/Cas9 最初的形式是一種引導裝置（CRISPR 部分），可引導分子剪刀（Cas9 酶）到達 DNA 的目標片段。 它們共同發揮基因工程巡航飛彈的作用，可以禁用或修復基因，或在基因被切割的地方插入新的東西。

即使 CRISPR/Cas9 系統具有所有遺傳功能，「仍然存在缺陷。 有些事情我們想做得更好，」麻省理工學院的分子生物學家張鋒說道，他是最早使用分子剪刀的科學家之一。 從 2013 年最早的使用 CRISPR/Cas9 切割人類和小鼠細胞基因的報告開始，張就描述了使系統更精確、更有效率地工作的方法。

他並不孤單。 近三年來的一系列論文對編輯器都有詳細的改進。 更進一步，包括張在內的一群科學家已經想出了讓 CRISPR 完成工具箱價值的工作的方法。

將 CRISPR 轉變為多工處理者通常首先要削弱尖端技術的尖端性。 在許多新的改造中，「死」的 Cas9 剪刀無法剪斷 DNA。 破損的剪刀可能聽起來毫無用處，但科學家們已將它們升級為染色體畫家、打字校正器、基因活動刺激器和抑制劑以及通用基因組修補器。

「最初的 Cas9 就像一把瑞士軍刀，只有一個用途：它是一把刀，」加州大學聖地牙哥分校的 RNA 生物學家 Gene Yeo 說。 但楊和其他研究人員將其他蛋白質和化學物質固定在鈍化的刀片上，並將刀變成了多功能工具。

張和同事也正在探索將系統的 Cas9 部分換成其他酶，這可能會擴大科學家對 DNA 和其他分子進行操作的類型。 借助擴展的工具箱，研究人員可能有能力揭開癌症和其他疾病的秘密，並回答有關生物學的新問題。

靈活指導

許多酵素可以切割DNA； 第一個發現於 20 世紀 70 年代，並幫助啟動了整個基因工程領域。 CRISPR/Cas9 的特殊之處在於其精確性。 科學家可以在一個選定的位置進行手術切片，而不是像早期工具那樣分散的方法。 最近的一些基因編輯技術，例如鋅指核酸酶和 TALEN，也可以鎖定單一目標。 但這些基因編輯器很難重新導向。 想要在基因組中剪下新位點的科學家必須建立一個新的編輯器。 這就像必須為地圖上的每個可能目標組裝一枚獨特的導彈。 有了 CRISPR/Cas9，就沒有必要了。

CRISPR 靈活性的秘訣在於其引導系統。 一小段 RNA 引導 Cas9 切割酶到達其 DNA 標靶。 「嚮導RNA」可以透過與DNA的包含訊息的構件或鹼基（以字母A、T、C和G表示）化學配對來定位研究人員選擇的任何位置。 製作新的引導 RNA 很容易； 研究人員通常只需輸入所需的鹼基序列即可在線訂購。

這個引導系統正在將基因工程師帶到他們從未去過的地方。 「有了 CRISPR，幾乎一夜之間，我職業生涯中最大的挫折就變成了一個本科生的業餘項目，」康乃爾大學的里德說。 “實在太棒了。”

里德研究如何在蝴蝶和飛蛾翅膀上繪製圖案。 顏色圖案是演化和發育生物學家幾十年來一直試圖回答的基本問題之一。 1994 年，Sean B. Carroll 及其同事發現了一種名為無遠端在蝴蝶翅膀上後來形成眼點的地方被打開。 該基因似乎是眼斑形成所必需的，但證據只是間接的。 里德說，這就是研究人員 20 年來一直陷入的困境。 他們無法操縱蝴蝶翅膀中的基因來獲得更直接的證據來證明不同基因在繪製翅膀圖案中的作用。

里德和康乃爾大學的同事張琳琳利用 CRISPR/Cas9 切割並禁用了無遠端在翅膀發育的早期階段基因，並得到了意想不到的結果：而不是引起眼斑，無遠端限制他們。 當 CRISPR/Cas9 被淘汰時無遠端,出現更多更大的眼斑，研究人員在 6 月報告自然通訊。 他說，Reed 和同事使用 CRISPR 剪斷了不只一種蝴蝶的基因，而是剪斷了六種不同蝴蝶的基因。

紐約市洛克菲勒大學的神經科學家 Marc Tessier-Lavigne 表示，CRISPR 切割基因的效果非常好，甚至可能太好了。 「Cas9 酵素的作用非常豐富。 它不斷地削減、重新削減、再削減，」他說。 這種持續的剪切可能會導致研究人員正在編輯的基因或他們從未打算觸及的基因發生不必要的突變。 Tessier-Lavigne 和同事發現了如何馴服過度渴望的酶並防止其將實驗室培養皿中生長的人類幹細胞的基因切成絲。 他們在 5 月 5 日報道稱，透過更好的控制，研究人員可以在與早發性阿茲海默症有關的兩個基因中產生一到兩個突變。自然。 將突變幹細胞培養成腦細胞表明，增加基因突變拷貝的數量也能促進澱粉樣蛋白-β肽的產生，這種勝肽在阿茲海默症患者的大腦中形成斑塊。 該技術可以使幹細胞更好地模擬人類疾病。

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儘管 Tessier-Lavigne 和其他人正在努力改進 CRISPR/Cas9 系統，建立更好的引導 RNA 並提高其切割的特異性，但一些研究人員正在完全放棄敏捷的 Cas9。

細緻入微的編輯

Cas9 並不能完全歸咎於它透過切斷 DNA 梯子的兩條軌道而導致雙股斷裂時所產生的混亂。 「細胞對雙股斷裂的反應是許多問題的根源，」哈佛大學化學生物學家 David Liu 說。 細胞修復 DNA 缺口的首選方法是將切割端重新黏在一起。 但通常會有一些鹼基缺失，或是位點卡在不屬於它們的地方。 劉引用哈佛大學同事喬治·丘奇的話表示，結果是基因組「破壞行為多於編輯行為」。

Liu 想要一種不會造成任何破壞性破壞的基因編輯器：它可以 A) 進入基因中的特定位點，B) 改變那裡的特定 DNA 鹼基，所有這些都不會切割 DNA。 這個工具並不存在，但在 Cas9 中，Liu 和同事看到了一個工具的組成，如果他們能稍微調整一下的話。

他們首先鈍化 Cas9 的尖端，有效地殺死這種酵素。 「死」的 Cas9 仍然可以抓住引導 RNA 並將其帶到目的地，但它無法切斷 DNA 的雙股。 隨後，Liu 及其同事附加了一種搭便車酶，該酶的作用是啟動一系列步驟，將DNA 鹼基C 變為T，或將G 變為A。才能實現這項改變。 一旦他們解決了這些問題，他們就可以對目標 DNA 的 15% 到 75% 進行永久性的單鹼基對改變不引入插入和刪除就像傳統的 CRISPR 編輯通常所做的那樣。 劉和合作者報告了這項成就自然在五月。 類似的鹼基編輯器，報告於科學日本研究人員在 8 月推出的這項技術可能有助於編輯細菌和其他不能忍受 DNA 切割的生物體中的 DNA。

DNA 鹼基交換有 12 種可能的組合。 劉使用的搭便車酶，胞苷脫氨酶，可以進行兩次交換。 Liu 和其他人正在致力於將酶與 Cas9 融合，從而實現其他 10 種酶的功能。 劉說，其他酵素的搭便車者可能使隨意編輯單一 DNA 鹼基成為可能。 這樣的鹼基編輯器可用於修復導致囊性纖維化或肌肉營養不良等遺傳疾病的單一突變。 它甚至可能糾正導致遺傳性乳癌的突變。

改寫分數

Dead Cas9 已經在幫助研究人員以前所未有的方式修補 DNA。 鈍刀片的變異可能有助於科學家解開生物學的一大謎團：同一組 20,000 個基因是如何在體內產生如此多不同類型的細胞的？

加州大學舊金山分校的生物化學家喬納森‧韋斯曼說，基因組就像一架鋼琴。 「只需 88 個按鍵，你就可以透過敲擊琴鍵的力度、混合哪些琴鍵以及時機來演奏各種各樣不同的音樂。” 透過在發育過程中精確的時間調低或調高基因組合的活性，細胞被誘導變成數百種不同類型的體細胞。

在過去的 20 年裡，研究人員透過觀察某些基因在不同細胞中何時開啟和關閉，並進一步了解了這個過程。 基因活性由令人眼花撩亂的各種蛋白質（稱為轉錄因子）控制。 轉錄因子發揮作用的時間和地點至少部分取決於DNA上的化學標籤和包裝它的組蛋白。 這些標籤統稱為表觀遺傳標記。 它們的工作方式類似於管弦樂團的樂譜，告訴轉錄因子「音樂家」要敲擊哪些音符以及演奏的音量大小。 到目前為止，科學家們只能聽到音樂。 Weissman 表示，利用死亡的 Cas9，研究人員可以創造出能夠改變樂譜中任何位置的表觀遺傳音符的分子，使研究人員能夠編排自己的音樂。

據稱表觀遺傳標記與成癮、癌症、精神疾病、肥胖、糖尿病和心臟病有關。 科學家們還無法證明表觀遺傳標記確實是這些疾病和其他疾病的背後原因，因為他們永遠無法進入細胞並僅改變一個基因上的一個標記來看看它是否真的產生酸味。

一種這樣的表觀遺傳標記，即一種稱為乙醯基的化學物質與組蛋白中特定胺基酸的連接，通常與活性基因相關。 但沒有人能肯定地說該標記是使這些基因活躍的原因。 杜克大學的 Charles Gersbach 及其同事去年在自然生物科技他們將死亡的 Cas9 與一種可以產生表觀遺傳標記的酵素融合。 當研究人員將表觀遺傳標記置於某些基因上時，這些基因的活性激增，證據顯示該標記確實可以增強基因活性。 有了這樣的 CRISPR 表觀遺傳編輯器，研究人員最終可能能夠糾正錯誤的標記，以恢復和諧與健康。

Weissman 的實驗室小組是最早將死亡的 Cas9 轉化為基因活動指揮者的小組之一。 研究人員發現，將死亡的 Cas9 停放在基因上足以透過阻斷將 DNA 複製成 RNA 的蛋白質來降低某些基因的活性。 將一種使基因沉默的蛋白質與死亡的 Cas9 融合，可以更好地抑制目標基因的噪音。 研究人員報告在細胞2014 年，他們使用沉默器（Weissman 及其同事稱之為 CRISPRi，意為幹擾）將某些基因的活性降低了 90% 至 99%。 一種類似的工具是透過將打開或活化基因的蛋白質與死亡的 Cas9（稱為 CRISPRa，活化劑）融合而創建的，可以讓研究人員提高某些基因的活動量。 7 月發表在《美國國家科學院院刊Weissman 和同事利用他們的活化方案來尋找使癌細胞對化療藥物產生抗藥性的新基因。

RNA革命

新的、改裝的 Cas9 不僅會讓 DNA 操作變得更容易。 它們還可以徹底改變 RNA 生物學。 Yeo 說，已經有多種分子工具可以抓取和切割 RNA。 因此，就他的目的而言，剪刀不是必要的，甚至是不可取的。 Yeo 發現 CRISPR/Cas9 的歸巢能力很有吸引力。

他一開始很簡單，使用經過調整的 CRISPR/Cas9 來標記 RNA，看看它們在細胞中的位置。 幸運的是，2014 年，加州大學柏克萊分校的 Jennifer Doudna（2012 年引入 CRISPR/Cas9 的研究人員之一）和同事報告說，Cas9 可以鎖定信使 RNA 分子或 mRNA（蛋白質構建指令的副本）包含在DNA中）。 在 4 月發表的一項研究中細胞、Doudna、Yeo 和同事將螢光蛋白綁在死 Cas9 的背面，將其指向 mRNA來自各種基因。

利用發光的 Cas9，研究人員追蹤了活細胞中幾個不同基因產生的 mRNA。 （先前精確定位細胞中 RNA 位置的方法會殺死細胞。）5 月，麻省理工學院的張和同事描述了一種雙色RNA追蹤系統在科學報告。 另一組研究人員描述了 CRISPR 彩虹，它可以在活細胞中賦予 DNA 多彩的光芒。 這種光芒讓團隊能夠精確定位多達六個基因的位置研究人員在 5 月的報告中指出，觀察細胞核中染色體的三維結構如何隨時間變化。自然生物科技。 加州大學舊金山分校的一個團隊在一月報道核酸研究它使用兩種顏色標籤的組合來追蹤多個基因。

但 Yeo 想做的不僅僅是觀察 RNA 的移動。 他設想將各種不同的蛋白質連接到 Cas9 上，以操縱和研究 mRNA 從 DNA 複製到讀取其指令以製造蛋白質之間所經歷的許多步驟。 更多地了解這個多步驟過程以及其他 RNA 在細胞中的作用可以幫助研究人員了解某些疾病中出現的問題，並可能了解如何解決這些問題。

張想要改進 Cas9，但他也想要其他多功能工具。 他和同事正在細菌中尋找這樣的工具。

CRISPR/Cas9 首次在細菌中被發現，作為抵抗病毒的基本免疫系統（SN：2015 年 12 月 12 日，第 12 頁 16）。 它瞄準病毒 DNA，然後將其粉碎。 研究人員最常使用的 Cas9 切割酶來自鏈球菌屬 化膿性細菌。

但科學家現在知道，幾乎一半的細菌都具有 CRISPR 免疫系統，並且許多細菌使用 Cas9 以外的酵素。 在細菌中新生弗朗西斯菌 U112張和同事發現了一種基因編輯酶 Cpf1，它的作用與 Cas9 略有不同。 該團隊去年 10 月在期刊中報告稱，它具有不同的「此處剪切」訊號，在某些情況下可能比 Cas9 更適合切割 DNA。細胞。 Cpf1還可以將一個長引導RNA切割成多個引導RNA，因此研究人員或許能夠同時編輯多個基因。 Cpf1 會切割 DNA，使 DNA 的一條鏈比另一條鏈稍長。 這使得將新基因插入 DNA 變得更加容易。

張最近在細菌中發現了一種酶細毛菌茶可以修補 RNA。 他和同事於 8 月 5 日在《科學》雜誌上報道稱，這種 RNA 切割酶稱為 C2c2科學。 與 Cas9 一樣，C2c2 使用嚮導 RNA 來引路，但是它不是切割 DNA，而是切割 RNA。

張的團隊正在探索其他 CRISPR/Cas9 類型的酶，這些酶可以幫助他們“更有效地或更有效地編輯或調節基因組或與基因組相互作用”，他說。 “我們的搜索還沒有完成。”

使用 CRISPR 的新方法的爆炸性增長尚未結束。 「這個領域發展如此迅速，」張說。 “只要看看我們在過去三年半中取得的進展，我認為未來幾年我們將看到的將會是驚人的。”

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本文發表於 2016 年 9 月 3 日號科學新聞標題是“CRISPR 煥然一新：基因編輯工具在一件事上做得很好，但這只是開始。”